【Nature Methods】类器官模型揭示癌症异质性研究全新视角

　　【Nature Methods】类器官模型揭示癌症异质性研究全新视角是一个充满异质性的世界，包含不同形状、大小和基因表达的细胞。与肿瘤相关的免疫细胞和成纤维细胞同样具有异质性，肿瘤微环境亦是如此。即便是相同癌症亚型的患者的肿瘤也各不相同。这种异质性可能会形成治疗反应上的巨大差异。

　　研究人员利用细胞系和小鼠来模拟这种异质性，一些人希望类器官（可以从细胞或微小肿瘤样本中培养出的3D结构）能帮助研究异质性如何塑造癌症生物学。

　　中国杭州西湖大学的蔡尚表示：“类器官领域在创造如实模拟器官功能的体外器官系统方面具有巨大潜力。”蔡及其同事已开发出了模拟乳腺发育和乳腺癌的小鼠类器官。辛辛那提儿童医院和大阪大学的Takanori Takebe及其团队从干细胞中生成肝脏类器官，以更好地了解肝脏生理和肝脏疾病，如癌前病变MASH。

　　类器官不是统一的结构，这是由于用于培养类器官的不同介质或源组织处理方式不同等因素造成的。科学家们希望能够制造出更具可重复性的类器官，并以规模化的方式培养、维持和操控类器官。

　　洛桑联邦理工学院和罗氏公司旗下人类生物学研究所的研究员Matthias Lütolf表示，与类器官相关的挑战尚未得到改善。类器官的潜力激励着研究人员去不断应对这些挑战。鉴于该领域仍处于早期阶段，对同一类器官有不同版本的研究也并非坏事。他表示，“这种多样性在学术研究中很有趣，也很有价值。”但要将类器官用于药物研发中的定量检测，还需要可重复性和标准化。

　　匹兹堡大学医学院和UPMC希尔曼癌症中心的癌症研究员Riyue Bao表示，与使用患者来源的细胞系不同，3D类器官培养能够研究肿瘤细胞与肿瘤微环境中其他细胞之间的相互作用。为了重现复杂的肿瘤微环境，可以将多个类器官连接成组装体。

　　Bao说，类器官的一个伦理优势是减少了动物实验。动物模型能够在中研究人类癌症生物学，但基因编辑工具可以更容易地用于类器官和组装体。除了患者来源的异种移植小鼠模型（PDX）外，科学家们还可以使用由PDX模型衍生的类器官，即PDxO。它们可以在体内和体外系统之间循环实验。相信PDxO可以作为一座桥梁，通过改进治疗方法，并以比以往更接近临床情况的方式研究癌症生物学！

　　类器官有助于解码癌症的最早阶段。Takebe和他的团队开发了肝胆胰类器官，他们使用肝脏类器官详细描述了MASH中肝纤维化的过程，该过程可进展为肝癌。他们应用基因编辑技术来操纵肝脏类器官中与代谢相关的基因，并确定了影响MASH代谢变化的遗传因素。

　　Lütolf喜欢光遗传学方法以空间和时间控制的方式激活致癌驱动突变。这种方法与生物工程支架相结合，有望构建出模拟癌症最早阶段的类器官模型。他和他的团队正在开发一种整合健康组织、肿瘤类器官和肿瘤微环境的支架。

　　通过使用他们的乳腺类器官，蔡的团队可以评估癌症发展初期发生的细胞间通讯。“通过诱导癌基因表达，我们可以观察和研究发生的初始细胞反应，”他说。

　　该团队成功培养和成像了这些类器官，并成功捕捉到了小鼠乳腺的发育、维持和发病过程，这让他们倍感欣慰。在一生中，腺体会随着青春期、怀孕和哺乳期的激素变化而变化。在体外，该团队可以模拟乳腺在体内发生的信号传导。

　　蔡教授说，科学家们目前正在开发人类微腺体，以“在人类体内无法实现的方式”研究人类乳腺生理学。他表示，从这些类器官中获得的见解可以增加对乳腺生物学的了解，并有助于开发更好的诊断和治疗乳腺癌的方法。

　　Bao表示，使用类器官来评估转移情况非常困难。其中一个原因是，在体内，肿瘤具有时间和空间上的侵袭性。但是，来自转移性肿瘤的类器官可以帮助科学家确定癌细胞是如何侵袭远处器官的。将实时成像和空间组学技术应用于类器官和组装体有望深入研究这一问题。

　　蔡教授的实验室已经培育出了一个小鼠乳腺微型腺体，该腺体能在体外反映小鼠乳腺器官的生理结构。下一步，研究小组将研究人类乳腺。引用自参考文献4，《Springer Nature》。

　　癌症会随着时间的推移逐渐恶化。要想用类器官来模拟这一过程，长时间维持类器官的状态是一个挑战，但蔡的实验室在一定程度上做到了这一点。他说，利用微型腺体，动态培养基能够模拟发情周期及其波动的激素。这种激素环境驱动着增殖-分化周期。类器官能在一段时间内保持功能，并模拟器官的生理过程。

　　Lütolf表示，类器官寿命有限的确是一个挑战，但还是有进步的。他和他的团队以及其他机构的同事探索了一种方法，即从肠道干细胞中培养出肠道隐窝形状的类器官。这种管状类器官内部可接触、可灌注。在某些情况下，这种肠道和其他上皮类器官能维持数周或数月的时间。他说：“这为模拟需要很长时间才能显现出来的生物过程提供了可能性。”几周以来，他和他的团队一直在用这种方法研究结直肠癌类器官的肿瘤生物学。

　　Bao建议通过测序和成像技术来追踪基因组漂移。“随着时间的推移，这确保了我们的类器官模型对其来源肿瘤的保真度，”她说。因为肿瘤类器官可能会逐渐偏离原始肿瘤的基因组特征，因此需要注意形状变化和标志物表达的改变。反复传代会导致肿瘤类器官失去其致癌特性。她说：“考虑到表观遗传变化和微环境影响等因素，我们正在积极研究这种可塑性背后的机制。”

　　荷兰乌得勒支公主玛克西玛儿童肿瘤中心和乌得勒支奥恩科德研究所的研究员Anne Rios表示半岛·体育网页版入口，在她的实验室中，类器官培养可以维持一年多。这通常是通过“传代”实现的，即每隔一周将类器官转化为单细胞悬浮液，然后在基质中重新生长。“这些培养物通常具有遗传稳定性，但这种稳定性会根据患者肿瘤样本的突变谱而变化，”她说。

　　Rios表示，他比较了一项研究中的各种癌症模型，包括657种癌细胞系、415种患者来源的异种移植小鼠模型、26种基因工程小鼠模型和131种患者来源的类器官。“总的来说，它们表明类器官表现出最高的转录保真度，尤其是与异种移植小鼠模型和癌细胞系相比，”她说。

　　“类器官需要精心关注培养基组成和培养条件，才能茁壮成长并保持其与原始肿瘤生物学的相关性，”Bao说。这是关于保留肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间的相互作用，这对癌症的进展和治疗反应至关重要。当她和她的团队使用来自头颈癌患者的类器官进行研究时，他们看到了高纯度的肿瘤类器官培养物。但是，当她们转向开发肺癌类器官时，她们遇到了难题。她说，她们咨询了其他研究人员并了解到，随着时间的推移，在没有仔细监督的情况下健康的肺类器官可能会战胜肿瘤类器官。的确，Takebe说，在培养过程中，在相互竞争的细胞类型之间取得平衡是关键。他还说，这项工作“仍在进行中”。蔡说，在培养乳腺腺体类器官时，必须小心遵循规程。“不能使用单一培养基来开发和维持这种微腺体，它需要一个逐步的诱导过程，”他说。干细胞会扩增，极性会建立，会发生对称性破坏和模式增强。他建议遵循已公布的方案。偏离方案有损害“类器官对真实事物的忠实度”的风险。建立患者来源的类器官所需的时间各不相同，生长速度也是如此。这可能是由于肿瘤分期、手术部位、代谢活动和固有的免疫特性导致的，目前尚不完全清楚。“从我们的角度来看，这种差异性对于理解疾病的异质性以及临床上观察到的治疗反应的多样性是非常宝贵的，”Bao说。

　　Takebe表示，许多类器官研究都是由日本科学家推动的，关注细节是日本文化的一部分。他笑着说：“也许这就是为什么我们对于这种非常复杂的方法开发过程泰然自若。”他看到越来越多的生物工程师进入类器官领域的第二阶段，在这个阶段，各团队致力于扩大类器官的生产规模并提高可重复性。他在辛辛那提的实验室使用机器人培养类器官。通过与分子设备公司的商业合作，他们向制药公司授权用于高通量测定的类器官。

　　Lütolf说，一个现实的体外癌症模型离不开对复杂肿瘤微环境关键方面的重现。“我们真的需要超越癌细胞培养本身，”他说。捕获癌细胞与微环境中主要细胞类型（尤其是免疫细胞、成纤维细胞和血管）之间的功能相互作用是必不可少的。

　　BEHAV3D是Rios实验室的一个平台，可以揭示T细胞攻击肿瘤的不同行为。一些(左)不攻击肿瘤类器官半岛·体育网页版入口，要么保持静止，要么死亡，而另一些(右)是“超级活跃分子”。引用自参考文献9，《Springer Nature》。

　　多伦多玛格丽特公主癌症中心的癌症研究员Tak Mak表示，毫无疑问，类器官在研究癌症细胞系中的作用更好。但他表示，类器官目前存在一个重要缺陷，即缺乏免疫系统。一些实验者尝试将淋巴细胞重新引入类器官，但在他看来，这并没有充分解决免疫细胞在生理或病理生理环境下的功能。淋巴细胞和骨髓细胞（如巨噬细胞等）都是如此。Mak表示，这些细胞的半衰期很短，尤其是巨噬细胞。要反映生理模式，就需要新鲜单核细胞的浸润和分化。神经和血管在健康器官中很重要，“在类器官中却缺失了，”他说。然而，感觉神经、副交感神经和交感神经都起着重要作用。血管则能将关键因子和营养物质输送到器官中。

　　Mak表示，类器官无疑是对小鼠模型进行的癌症研究的补充。小鼠很容易繁殖。人们可以在这些动物身上获取组织和免疫细胞，并匹配小鼠中的肽-主要组织相容性复合物和抗原特异性T细胞。但小鼠和人类在许多病理生理方面存在差异。小鼠的端粒（染色体末端的DNA序列）长度是人类的三倍。小鼠和人类的骨髓细胞也有所不同。例如，小鼠骨髓细胞上的免疫球蛋白样信号受体PirA和PirB有5到6个人类对应物，包括人类免疫球蛋白样受体LILRA和LILRB。

　　Takebe表示，目前制作类器官的实验室还缺乏从干细胞合成产生功能性免疫细胞的有效方法。与从患者血液中提取的免疫细胞共培养是捕获个体免疫特征的一种方法。但他表示，即便是这种方法，做起来也并不容易，可以说是“一种理想实验”。胎儿肝脏环境是造血细胞和血细胞发育过程的适宜环境。人们可以在肝类器官中添加这样的小生境成分，以尝试调控发育和分化谱系半岛·体育网页版入口。他和他的团队正在类器官培养中开发胎儿肝脏生态系统，以产生具有模型免疫系统的系统。

　　Takebe高度评价了Lütolf实验室用于构建工程可灌注系统的方法。他和他的团队采用的另一种方法是将类器官植入免疫缺陷小鼠等动物体内，以利用动物的循环系统和内分泌系统。这延长了类器官的寿命，使科学家能够在体内对逐渐成熟的类器官进行表征。科学家们正在增加肝类器官的复杂性，例如在器官发育的适当时机，在正确的空间坐标上添加细胞类型。该计划旨在将学到的原理转化为诱导未成熟祖细胞形成复杂组织的方法。

　　Bao使用患者来源的类器官来研究治疗方法和耐药性机制。她和她的团队探索了p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与免疫检查点结合使用的效果。这个想法来源于一项临床试验，该试验中的患者采用这种治疗方案后，那些常规疗法无效的患者癌症得到缓解。患者来源的类器官和小鼠模型将有助于理解不同的反应。

　　她说，在理想情况下，每个患者的肿瘤都应该有一个类器官的“化身”，以便能够治疗该系统，进而监测患者的治疗情况。她还希望将肿瘤类器官与肿瘤微环境中的免疫细胞共培养。

　　在儿科癌症研究工作中，Rios专注于免疫机制，并意识到残酷的现实——癌症是儿童疾病中的头号杀手。她说，儿科癌症的治疗选择落后于癌症，尤其是实体瘤和脑瘤。与癌症不同，儿童癌症源自胚胎组织，“但我们仍然在使用为设计的治疗方法，”她说。与乳腺癌相比，儿科癌症相对罕见，获得的资助也较少。她和她的团队希望利用BEHAV3D来揭示儿科癌症的不同之处，BEHAV3D是她和她的团队以及其他大学的同事共同开发的。这个基于成像的平台用于评估免疫疗法中使用的工程化T细胞，这种疗法利用T细胞定位和物理破坏癌细胞的能力。BEHAV3D揭示了使用不同类型T细胞受体改造的T细胞之间的行为差异。转录组学分析和基于成像的读数分析表明哪些是“超级接合杀手T细胞”。

　　在弥漫性中线胶质瘤患者的治疗中，工程T细胞展现出了一些鼓舞人心的成效。然而，几个月后癌症会复发。科学家们正在利用BEHAV3D平台对患者来源的肿瘤类器官进行研究，以比较针对这种脑肿瘤的几种工程化T细胞的疗效。他们希望找到具有最强接合性的工程T细胞产品。一旦找到癌症类器官，“它们就会附着在上面，直到类器官被杀死为止，”她说。这些超级接合T细胞可能为目前无法治愈的小儿脑瘤提供免疫治疗的新方法。该平台可以用来全面分析工程化T细胞产品的细胞组成、功能、优点和缺陷。

　　她说，BEHAV3D能够捕捉到个体肿瘤的复杂性和组成如何影响T细胞的反应。它可以显示治疗何时失效——当T细胞似乎变得懈怠、速度放缓，甚至忽视肿瘤类器官，而不是攻击它们时。BEHAV3D有一个模块，用于比较不同患者肿瘤对T细胞的不同反应，它还可以用来评估同一肿瘤内的差异。使用类器官可以模拟这些差异和变化。

　　因此，类器官显示生物学差异的方式模仿了个体肿瘤的复杂性。这些变异会影响T细胞治疗的时效性，也许不是所有的类器官都同时被杀死。一些类器官可能比其他类器官更容易受到工程化T细胞的攻击。她说：“我们目前正在研究这与在患者身上观察到的此类疗法反应的异质性之间的关系。”她表示，未来的计划是扩大该平台的功能，以包括其他免疫疗法，如双特异性抗体。

　　Bao表示，先进的成像技术、计算生物学和机器学习正在极大地改变类器官在癌症研究中的用途。通过高分辨率成像技术，研究人员可以实时观察细胞行为和相互作用。计算模型和机器学习算法可以根据复杂的数据模式预测结果。它可以识别人眼无法识别的基因表达、细胞形态和运动的模式和变化。

　　她说：“这些技术为了解肿瘤的异质性及其对药物的反应在前所未有的细节水平上开辟了新的途径。”当然，类器官在培养和建模方面存在诸多挑战，但她表示，“我相信它们在解开癌症生物学和个性化医学的复杂性方面是不可或缺的。”